「3张图」分享多糖PAS染色学习笔记：6步操作，精准染色结果轻松到手

PAS染色操作简单仅需6步。但你的片子为什么会“整张的淡红色看不到糖原呢”或者“满满的紫红色根本找不到细胞核”这就需要我们洞察PAS染色的核心原理和操作细节了。「IHC急救室」第20篇我们将会对PAS染色原理、操作关键参数、应用场景及不同组织的特殊要求进行汇总分析助你获得精准染色结果。一、什么是PAS染色PAS染色Periodic Acid-Schiff stain即过碘酸-雪夫染色、糖原染色是组织化学或病理特殊染色中经典的方法之一。该方法最早由McManus于1946年用于显示黏蛋白后来被广泛用于糖原检测。除此之外PAS还用于基底膜、软骨基质、真菌细胞壁、阿米巴滋养体等染色。二、PAS染色的原理PAS染色主要涉及3种化学反应1氧化过碘酸HIO4将糖原分子中相邻两个碳上的羟基-OH氧化为醛基-CHO。2显色Schiff试剂无色品红与新生成的醛基反应形成紫红色/洋红色复合物。3复染苏木素将细胞核染成蓝色。因此PAS染色的最终结果为· 糖原、黏蛋白、基底膜等紫红色· 细胞核蓝色· 肌纤维、红细胞红色正常肾NK和慢性肾病CKD组织的PAS染色结果源自文献George SK, et al. Potential Use of Autologous Renal Cells from Diseased Kidneys for the Treatment of Renal Failure特别提醒PAS阳性并不等于含糖量高。因为除了糖原这些物质也会呈现阳性三、PAS染色主要操作步骤四、PAS进阶D-PAS和AB-PAS常规PAS染色无法区分糖原与其他多糖物质。为解决这一问题D-PAS染色淀粉酶消化PAS染色应运而生可实现糖原的特异性检测。D-PAS核心原理在PAS染色前用淀粉酶对组织切片进行处理。淀粉酶能水解糖原的α-1,4糖苷键结构将其分解为水溶性的麦芽糖从而将其从组织中去除。经淀粉酶消化后的切片再进行PAS染色原糖原占据的区域不着色其余不被淀粉酶消化的阳性物质则正常显示以此确定切片中的紫红色是否为糖原着色。操作要点选取两张连续的切片。其中一张作为对照组直接进行常规PAS染色另一张作为实验组先用淀粉酶溶液消化处理37℃孵育30-60分钟再进行常规PAS染色。最后在显微镜下对比观察两张切片。结果判读若对照组呈紫红色而实验组对应区域颜色消失则判断组织中存在糖原。若两张切片的染色结果一致则说明组织中不含糖原。AB-PAS核心原理黏膜上皮细胞分泌的黏液分为中性黏液和酸性黏液如何精准区分二者PAS染色结合AB阿利新蓝可实现。AB-PAS将酸性黏液染成蓝色中性黏液染成红色同时含有酸性和中性成分的混合型黏液会呈现紫蓝色或蓝紫色。其常用于胃癌分型和肠上皮化生诊断。操作要点切片在脱蜡水化后先用pH 2.5的阿利新蓝染色15-20分钟水洗后进行常规PAS染色。结果判读中性黏液物质呈红色或红紫色酸性黏液呈蓝色。4例肺腺癌患者的三种黏液染色结果对比图源自文献Patrick Micke, et al. Mucin staining is of limited value in addition to basic immunohistochemical analyses in the diagnostics of non-small cell lung cancer五、PAS在病理研究中的应用PAS染色的应用范围越来越广泛。其可将组织中的黏多糖物质染成紫红色用于判断肿瘤组织是否分泌糖原及推断肿瘤细胞的起源或是否发生血管浸润。PAS对真菌特异性强、着色鲜艳是常用的真菌病诊断方法。PAS还用于观察心血管疾病缺血缺氧早期的心肌坏死或梗死区的糖原减少、支气管黏膜的杯状细胞检测、鉴别细胞内的空泡状变性等。不同组织的结构特性存在差异进行PAS染色时需针对性调整操作参数才能获得精准、清晰的染色结果具体特殊要求如下· 肾脏组织切片需比常规的薄2-3μm避免厚切片造成基底膜结构重叠影响结果。为获得稳定的细胞核染色及清晰的基底膜轮廓建议用天青石蓝-苏木素进行核染。PAS染色是肾活检的常用技术需重点观察肾小球基底膜厚度、系膜基质、系膜细胞形态。· 肝脏组织因含有大量糖原推荐用Carnoy液进行固定同时需设置淀粉酶消化对照以排除其他PAS阳性物质的干扰。染色后重点观察肝细胞内的糖原颗粒分布、数量及形态。· 骨髓或血液涂片可用95%乙醇固定5分钟因细胞层较薄过碘酸氧化时间可缩短至5分钟Schiff染色时间与石蜡切片基本一样。染色结果重点观察糖原形态。· 真菌组织细胞壁多糖且致密氧化时间可延长至10-15分钟确保氧化充分。多糖不是糖原不需要做淀粉酶对照。可同时做GMS六胺银染色进一步提高染色对比度。总之PAS染色常用于糖原及多糖物质的检测操作流程简便。我们在实验过程中遇到切片呈均匀淡红而没有糖原信号时不要惊慌。我们可以对着实验记录本和关键试剂的配制日期或开封日期进行系统溯源抠每一个细节比如氧化环节是否充分、试剂是否失效、酸性分化步骤是否过度、阳性和阴性对照设置是否规范等。