《联合靶向 TMEM16A 新型单抗与西妥昔单抗抑制食管鳞癌增殖与转移》

一、文章基础信息该论文于2024 年 11 月发表于《Journal of Translational Medicine》《转化医学杂志》SCI 期刊IF≈8 分研究依托北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所癌变与转化医学教育部重点实验室为核心单位完成。研究行业背景我国食管癌发病占全球半数以上食管鳞状细胞癌ESCC国内发病率 5.6/10 万农村高发区死亡率可达 12.7/10 万现有 EGFR 靶向药西妥昔单抗单药用于晚期 ESCC 转移抑制疗效有限小分子 TMEM16A 抑制剂因胞内环境干扰、稳定性差均止步临床前研究全球尚无靶向 TMEM16A 治疗实体瘤的治疗性单克隆抗体报道。TMEM16A 为钙激活氯离子通道在头颈鳞癌、食管鳞癌中基因扩增异常高表达与肿瘤侵袭转移、不良预后强相关且 TMEM16A 与 EGFR 存在蛋白互作与正向调控环路是 ESCC 双靶点联合靶向的潜在突破口本研究立足该空白开展新型单抗研发与联合靶向药效及机制研究。二、摘要整体研究思路本研究以TMEM16A 为全新抗体靶向靶点、EGFR 为成熟靶向靶点首先通过临床样本与细胞功能学验证 TMEM16A 高表达促进 ESCC 侵袭转移且与 EGFR 表达正相关、二者存在蛋白相互作用经小鼠免疫 - 杂交瘤筛选获得 6 株抗人 TMEM16A 单抗筛选出功能最优的mT16A#5体外证实该单抗可剂量依赖性抑制 ESCC 细胞迁移侵袭、阻断 TMEM16A 氯通道活性基于 TMEM16A-EGFR 调控轴将 mT16A#5 与临床 EGFR 靶向药西妥昔单抗联用体内外共同证实双抗联用具备协同抑瘤、抗转移效果机制层面明确 mT16A#5 通过下调 PI3K/AKT/JNK 通路蛋白磷酸化水平阻滞下游促癌信号最终首次实现 TMEM16A 治疗性单抗研发为食管鳞癌双靶点抗体联合靶向治疗提供全新临床前实验依据。三、分模块研究结果、实验设计与对应图表解析本研究整体分为5 大核心结果模块结果 1TMEM16A 高表达促进 ESCC 细胞运动与淋巴结转移1实验设计① 细胞层面选用 9 株不同转移潜能 ESCC 细胞高转移 KYSE30lm3/KYSE450lm2、亲本 KYSE30luc/KYSE450luc 等WB/qPCR 检测内源 TMEM16A 表达构建 TMEM16A 稳转敲低 / 过表达细胞株Transwell 迁移侵袭、CCK-8 增殖实验验证表型② 临床样本98 例 ESCC 组织芯片多色免疫荧光mIHC统计 TMEM16A 表达与淋巴结转移、TNM 分期、年龄性别临床参数关联性表 1。2实验结果结论TMEM16A 是 ESCC 促转移关键靶点高表达是 ESCC 淋巴结转移不良预后标志物。结果 2成功制备抗 TMEM16A 单抗筛选得到功能性抗体 mT16A#51实验设计BALB/c 小鼠经 TMEM16A 真核质粒免疫脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合建杂交瘤ELISA 初筛获得 6 株单抗利用 TMEM16A 胞外 4 段 GST 重组蛋白验证抗体结合区段MQAE、EYFP-H148Q/I152L 双荧光探针检测单抗对氯通道活性抑制梯度浓度5/10/20μg/mLmT16A#5 处理高转移 ESCC 细胞Transwell 验证剂量依赖性抑迁移侵袭效果。2实验结果结论mT16A#5 特异性靶向 TMEM16A 第 4 胞外区兼具通道阻滞与抑肿瘤细胞侵袭双重活性是候选治疗性抗体。结果 3TMEM16A 与 EGFR 在 ESCC 中双向调控、蛋白互作1实验设计TCGA 数据库生信关联分析 98 例临床组织 mIHC 共染Co-IP/Pull-down 验证蛋白结合分别构建 TMEM16A/EGFR 单敲低、双敲低细胞株WB 检测 EGFR 总量及磷酸化pY992/pY1068、MQAE 检测氯通道活性EGFR 敲除细胞给药 mT16A#5验证抗体药效是否依赖 EGFR。2实验结果结论TMEM16A 与 EGFR 形成正反馈调控环路是双靶点联合用药的分子基础。结果 4mT16A#5 联用西妥昔单抗协同抑制 ESCC 体内增殖与转移1实验设计体外单药mT16A#5、西妥昔单抗、联合用药处理 KYSE30lm3TranswellCCK8 检测迁移侵袭、增殖体内构建小鼠足垫原位转移模型肺转移观测、皮下成瘤模型肿瘤生长观测分组PBS 对照组、mT16A#5 单药10mg/kg、西妥昔单抗单药1mg/kg、双抗联用组每周 2 次给药连续 4 周监测小鼠体重、肿瘤重量、活体荧光成像评估转移负荷。2实验结果结论mT16A#5 西妥昔单抗具备显著体内外协同抗 ESCC 增殖与转移活性动物体内耐受良好。结果 5mT16A#5 通过抑制 PI3K-AKT/JNK 磷酸化阻断下游促癌信号对应图 5、附图 S51实验设计梯度 mT16A#55/10/20μg/mL处理 ESCC 细胞WB 检测 EGFR、p-EGFR、PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT、JNK/p-JNK、自噬标志物 LC3B/BCL2转录组测序筛选高低转移株差异基因qPCRMSD 超敏 ELISA 定量细胞上清炎症因子IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α 等。2实验结果结论mT16A#5 核心抑癌机制为阻滞 PI3K-AKT/JNK 磷酸化级联通路下调 EGFR 蛋白稳定性不依赖自噬通路。讨论小结现有 TMEM16A 抑制剂均为小分子存在脱靶、体内稳定性差无法上临床的短板本研究全球首次开发靶向 TMEM16A 功能性治疗单抗依托 TMEM16A-EGFR 互作环路联合临床成熟靶向药西妥昔实现协同增效突破西妥昔单药在食管鳞癌疗效不足的临床痛点为晚期转移性 ESCC 靶向新药开发提供全新策略。