卡梅德生物技术快报｜噬菌体筛选：技术实操：宽谱大肠杆菌噬菌体筛选全流程与性能验证方案

在微生物抗菌技术研发领域针对耐药性致病菌的噬菌体研发是当下热门方向。畜禽源大肠杆菌耐药性逐年加剧常规抗菌方案失效促使行业加大对裂解性噬菌体的研发投入。而宿主谱狭窄是天然噬菌体的共性技术痛点这就要求研发人员建立标准化、可复现的噬菌体筛选流程定向筛选宽谱活性噬菌体。本文结合完整实验案例详解从样本采集、菌株分离、噬菌体筛选到性能验证的全流程技术要点同时展示试验数据与技术结论为同类微生物研发项目提供实操参考。本次试验目标为从养殖污水中完成噬菌体筛选获得可裂解猪、鸡、牛多源大肠杆菌的宽谱噬菌体并完成体外杀菌效果量化评估。试验前期核心工作为样本采集与致病菌分离鉴定这是噬菌体筛选的基础前提。试验样本采集自辽宁、北京、新疆三地规模化养殖场包含患病畜禽病灶样本与养殖污水样本所有样本低温冷藏转运至实验室避免微生物失活。细菌分离采用选择性培养基分离法分别使用麦康凯培养基、伊红 - 美蓝培养基划线接种37 ℃恒温培养 24 h 后挑取典型菌落。大肠杆菌在两种培养基上会形成特征性菌落结合革兰氏染色镜检菌体为红色杆状完成初步判定。初筛菌株进一步接入 LB 液体培养基振荡培养制备对数生长期菌液。分子鉴定环节采用 16S rRNA PCR 技术取菌落制备 DNA 模板使用通用引物进行扩增扩增产物电泳后条带约 1500 bp与目标片段一致。扩增产物测序后上传至 NCBI 数据库比对最终确认 18 株目标大肠杆菌菌株分类猪源 2 株、牛源 2 株、鸡源 14 株。标准化的菌株分离与鉴定流程保证了宿主菌的纯度从源头规避噬菌体筛选过程中的杂菌干扰。菌株库搭建完成后进入核心环节 ——噬菌体筛选、分离与纯化。试验选用养殖污水作为噬菌体分离基质具体操作参数如下污水样本 8000 r/min 离心取 1 mL 上清液混合 20 μL 对数期宿主菌液、1 mL LB 液体培养基设置培养条件为 37 ℃、140 r/min连续培养 12 h。培养结束后再次 8000 r/min 离心 10 min取上清液经 0.22 μm 无菌滤膜过滤去除活菌与杂质得到粗制噬菌体液。噬菌体纯化采用行业通用的双层平板法底层为凝固的 LB 固体培养基上层为混合了宿主菌的 LB 半固体培养基滴加 10 μL 粗制噬菌体液37 ℃孵育 4 h 后观察噬菌斑。为保证噬菌体为单一毒株连续纯化 3 次最终获得噬菌斑形态统一的烈性噬菌体 vB_Eco_E10。在噬菌体筛选实操中离心转速、滤膜孔径、培养温度等参数直接影响分离成功率0.22 μm 滤膜可完全截留细菌仅允许噬菌体通过是该环节的关键质控点。完成噬菌体纯化后依次开展宿主谱测定与体外杀菌试验量化评估噬菌体的核心性能。第一部分宿主谱测定针对 18 株大肠杆菌逐一进行裂解试验操作方式与纯化阶段一致通过噬菌斑有无判定裂解活性。试验结果统计vB_Eco_E10 对 9 株菌株具备裂解能力整体裂解率 50%其中猪源菌株裂解 1 株、牛源菌株裂解 1 株、鸡源菌株裂解 7 株实现跨物种裂解达到宽谱噬菌体的筛选目标。第二部分为 12 h 动态体外杀菌试验试验载体选用 24 孔细胞培养板体系配置3 mL LB 液体培养基 100 μL 菌液浓度 1×10⁵ CFU/mL100 μL 噬菌体液浓度 1×10⁸ PFU/mL。试验分组设置噬菌体 菌株组、纯菌株对照组、空白 PBS 对照组每组设置 3 个生物学重复。每间隔 1 小时设置一组试验孔培养 12 h 后统一使用酶标仪检测 OD600 数值以此表征细菌生物量。试验最终量化数据如下所有受试菌株在培养 4~5 h 进入对数生长期7 h 后生长放缓。对比对照组与试验组 OD600 数值培养 12 h 后噬菌体对猪源菌株 LNE10 的抑菌率为 36.8%对鸡源菌株 LNB27、牛源菌株 LNL14 的抑菌率均为 15.8%。数据反映出该噬菌体对不同来源大肠杆菌的裂解能力存在差异猪源菌株抑制效果最优鸡源、牛源菌株效果次之该现象与不同菌株表面噬菌体受体的表达量相关。从技术层面分析本次通过噬菌体筛选得到的 vB_Eco_E10其跨物种裂解特性证明该噬菌体识别的受体在畜禽源大肠杆菌中具有保守性这也是宽谱噬菌体的典型特征。总结整套试验流程与技术要点样本溯源选择本土养殖污水能提升噬菌体筛选的适配度双层平板法结合多次纯化可保障噬菌体单一性多源菌株库能全面验证噬菌体宿主谱。本次试验得到的 vB_Eco_E10 各项性能指标稳定可纳入噬菌体资源库作为复合噬菌体制剂的核心原料。对于微生物研发团队而言本套标准化流程可直接应用于其他致病菌的噬菌体筛选工作。后续技术优化方向可聚焦于扩大菌株验证范围、优化培养条件提升噬菌体活性、开展多噬菌体复配试验进一步提升杀菌谱与抑菌效率推动该技术从实验室走向产业化应用。参考文献宋蕊刘衍芬贺永明等.1 株宽谱型大肠杆菌噬菌体筛选及杀菌效果评估 [J]. 辽宁农业职业技术学院学报2026,28 (3):1-4.