PAR-CLIP-seq ：描绘RNA-蛋白质相互作用图谱

PAR-CLIP-seqPhotoactivatable Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and lmmunoprecipitation sequencing即基于光活化核糖核苷的交联和免疫沉淀测序技术[1]将具有光活性的核糖核苷类似物4sU掺入到新转录的RNA中再通过分析碱基T-C转换位点可在全转录组范围内研究RNA与蛋白的相互作用揭示靶向RBP的RNA结合位点。01技术优势紫外交联效率高是CLIP-seq的100~1,000倍分辨率高定位到结合位点特异性高02技术应用鉴定全转录组RNA与蛋白质直接结合位点揭示全转录组RNA—蛋白质相互作用03送样要求活细胞≥3*107个细胞/样本04技术原理将具有光活性的核糖苷类似物4sU插入到活细胞的新生RNA转录本中在365nm紫外灯辐射的细胞中4sU标记的RNA被诱导与RBP相互作用免疫共沉淀所要的RBP然后分离被交联和共沉淀的RNA。RNA随即被转换成cDNA文库并且进行深入测序。4sU的处理令交联的序列产生T-C的转变因此通过PAR-CLIP所准备的cDNA文库能够准确的定位交联的位置。05分析内容原始数据质控、过滤参考基因组比对Peak callingPeak注释GO富集分析KEGG富集分析Motif分析信号矩阵分析Peak热图CIMS 分析可视化文件差异分析若有多组样品可找出差异结合位点06结果示例图1. IGV峰图图2. Motif分析[2]图3. 信号分布热图图4. CIMS分析突变频率[3]06研究案例《NAR》RNA结合蛋白 PRRC2B 介导特定 mRNA 的翻译并调节细胞周期进程[4]越来越多的证据表明基因表达的转录后控制包括 RNA 剪接、运输、修饰、翻译和降解主要依赖于 RNA 结合蛋白 (RBP)。然而许多 RBP 的功能仍未得到充分研究。此研究中鉴定了一种新 RBP——PRRC2B的功能。通过PAR-CLIP-seq研究者在HEK293T 细胞中一组特定 mRNA上的翻译起始密码子附近鉴定了全转录组富含 CU-或 GA 的 PRRC2B 结合位点。后续通过更多的机制研究表明 PRRC2B 对于有效翻译细胞周期进程和细胞增殖所需的特定蛋白质至关重要。图5. PAR-CLIP-seq结果显示 PRRC2B -mRNA相互作用07参考文献PAR-CLIP (Photoactivatable Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and lmmunoprecipitation): a step-by-stepprotocol to the transc riptome - wide identification of binding sites of RNA-binding proteins. Methods Enzymol.2014:539:113-61Hou L, Wei Y, Lin Y, et al. Concurrent binding to DNA and RNA facilitates the pluripotency reprogramming activity of Sox2. Nucleic Acids Res 2020 Apr 17;48(7)Ransey E, Björkbom A, Lelyveld VS, et al. Comparative analysis of LIN28-RNA binding sites identified at single nucleotide resolution. RNA Biol 2017 Dec 02;14(12)Jiang F, Hedaya OM, Khor E, et al. RNA binding protein PRRC2B mediates translation of specific mRNAs and regulates cell cycle progression. Nucleic Acids Res 2023 Jun 23;51(11)